馬鈴薯莖尖超低溫冷凍脫毒方法一般按照選擇材料、切取莖尖、預(yù)培養(yǎng)、預(yù)處理、超低溫冷凍、解凍、恢復(fù)培養(yǎng)、脫毒效果檢測、組織培養(yǎng)擴繁這幾個步驟來獲得再生植株，經(jīng)過病毒檢測后，無毒植株用于生產(chǎn)脫毒馬鈴薯種薯(圖2)。液氮罐

 

1. 選擇材料

馬鈴薯不同部位的組織經(jīng)過超低溫冷凍處理后細(xì)胞的存活力有明顯差異。一般細(xì)胞體積小細(xì)胞質(zhì)較濃、液泡少的分生組織細(xì)胞會比液泡大的成熟的分化細(xì)胞再生能力強、成苗率也高。研究發(fā)現(xiàn)選擇馬鈴薯莖尖分生組織作為處理對象，可以提高成苗率，有利于獲得脫毒苗。

2. 預(yù)培養(yǎng)材料

材料通過預(yù)培養(yǎng)使得細(xì)胞適度脫水，減少細(xì)胞內(nèi)自由水含量，可以提高細(xì)胞的抗冷凍能力，從而提高成活率。目前*常用的預(yù)培養(yǎng)方式是在培養(yǎng)基中添加一些使細(xì)胞脫水的保護(hù)性物質(zhì)，可以選用蔗糖、二甲基亞砜、甘露醇等。在高濃度保護(hù)性物質(zhì)處理之前選用0~5℃的低溫馴化，可以明顯提高成活率。馬鈴薯莖尖可以切取2~3mm大小，然后放在0.3mol·L-1高蔗糖濃度的預(yù)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)一天，光照16h，光照強度2000lx。高濃度的蔗糖可增加培養(yǎng)基的滲透壓，使得馬鈴薯莖尖組織的細(xì)胞脫水，從而減少細(xì)胞內(nèi)自由水的含量。

3. 保護(hù)劑處理

常用的抗冷凍保護(hù)劑是能夠穿透細(xì)胞膜的化合物DMSO和各種糖類物質(zhì)，通過促進(jìn)細(xì)胞膜對水分的通透性，降低細(xì)胞內(nèi)水分冰點溫度，避免胞內(nèi)外冰晶形成，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)。保護(hù)劑的選擇是超低溫處理成功的關(guān)鍵因素，好的保護(hù)劑應(yīng)該滿足對細(xì)胞毒性小、易溶于水、解凍后容易從細(xì)胞中清洗掉等要求。目前常用Sakai于1990年創(chuàng)立的按照一定配方合成的多種保護(hù)劑復(fù)合液，被稱為植物材料玻璃化溶液(plant vitrification solution，PVS)。將預(yù)培養(yǎng)一天后的馬鈴薯莖尖加載到PVS2溶液中，其中PVS2液的成分為：MS+30%(W/V)甘油+15%(W/V)乙二醇+15%(W/V)二甲基亞砜(DMSO)+0.4mol·L-1蔗糖。具體方法是用移液管吸取15μL的PVS2溶液加在0.03mm厚的1.0cm×4.0cm的鋁箔上，然后將預(yù)培養(yǎng)后的馬鈴薯莖尖裝載到PVS2液滴中，室溫25℃下處理20min，成活率可達(dá)90%。

4.液氮冷凍處理

將包裹有馬鈴薯莖尖的鋁箔在液氮中蘸一下，然后把鋁箔條放入1.5mL離心管中，再將離心管置于液氮中超低溫處理1h。

5. 解凍洗滌

對超低溫處理后的材料需要馬上進(jìn)行解凍，常用的解凍方法有兩種：一是快速解凍法，適合于大多數(shù)材料，具體做法是將液氮中冷凍1小時后的材料放于25~40℃的水浴鍋中進(jìn)行解凍1~3min完全融化后取出材料，避免水浴溫度對細(xì)胞的熱傷害以及保護(hù)劑對細(xì)胞的毒害作用。另一種是慢速解凍法，適用于經(jīng)過低溫馴化或者經(jīng)過脫水處理的材料，把液氮處理1h后的材料在0℃下慢速解凍30min左右。解凍后的材料一般都需要立刻洗滌，為了除去細(xì)胞內(nèi)含的高濃度保護(hù)劑，避免對恢復(fù)培養(yǎng)的影響。*常用的洗滌方法是室溫下用含1~2mol·L-1蔗糖濃度的培養(yǎng)基洗滌10min左右。在無菌超凈工作臺中，將液氮處理1h后的包裹馬鈴薯莖尖鋁箔條從離心管中取出，然后迅速放入加有1.2mol·L-1蔗糖濃度的液體MS培養(yǎng)基中洗滌2~3次，每次10min。液氮罐

6. 恢復(fù)培養(yǎng)

經(jīng)過洗滌后的材料需要立即轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)將材料先培養(yǎng)在黑暗或弱光下一段時間后，再在正常光照下有利于形成再生植株。

將洗滌后的馬鈴薯莖尖在無菌超凈工作臺中取出，用無菌紙吸去殘留在材料表面的洗滌培養(yǎng)基，接種到固體恢復(fù)培養(yǎng)基(MS+0.1mg·L-1NAA+0.5mg·L-16-BA+1.0mg·L-1GA3)上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件選擇先黑暗培養(yǎng)7d，再在弱光1000lx下培養(yǎng)7d，然后正常光照2000lx培養(yǎng)。當(dāng)分化出根芽后轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上，1個月就可獲得完整植株，統(tǒng)計成活率。

7. 病毒檢測

對再生馬鈴薯試管苗用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行病毒檢測，只有不帶病毒的組培苗才可以進(jìn)行組織培養(yǎng)擴繁，用于生產(chǎn)無毒馬鈴薯種薯。液氮罐